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實驗助手—六大要素讓你告別RNA反轉(zhuǎn)錄失敗

更新時間:2017-09-26點擊次數(shù):5639

RT Primer的佳選擇

通常RT primer可分為三類:oligo dT,隨機(jī)引物以及基因特異性引物。Oligo dT引物之所以應(yīng)用范圍更加廣泛,是因為可由此獲得mRNA的全長拷貝。

然而如果mRNA長度過長>4kb,或者沒有polyA尾(原核mRNA或rRNA),就需要考慮使用隨機(jī)引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)引物雖能長基因的5’末端的轉(zhuǎn)錄,但并不能獲得整個基因全長的cDNAs,且對RNA樣品質(zhì)量要求比較高,此時可用6-8個核酸聚合體來提高cDNAs的合成量。

而對于真核生物的qPCR,長隨機(jī)引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個漂亮的結(jié)果。針對此類優(yōu)化混合引物,已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力:Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit。

第三個選擇就是基因特異性引物,僅擴(kuò)增需要的cDNA,適用于目的序列已知的情況。通常在一步RT-PCR法中可使用此類引物,因為該引物也可用作為PCR中的反向引物。

RNA的二級結(jié)構(gòu)

若要獲取全長RNA的反轉(zhuǎn)錄,那么RNA二級結(jié)構(gòu)的問題就不可忽略,因為反轉(zhuǎn)錄酶在遇到此類結(jié)構(gòu)后會終止反應(yīng)或從模板上脫落下來。

也許你很難判斷RNA是否具有二級結(jié)構(gòu),但如果基因中GC含量較高,通常意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈,此時就需要在65℃ 5min對其進(jìn)行充分變性,以避免其對實驗結(jié)果的影響。

另外,還有一種方法可解決此問題,即使用一種適溫度高于正常標(biāo)準(zhǔn)(37℃-42℃)的逆轉(zhuǎn)錄酶。比如來自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)然也存在一些即使在常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄溫度(37℃-42℃)的條件下,也能跨過RNA二級結(jié)構(gòu)的率逆轉(zhuǎn)錄酶,即使是針對富集GC序列的RNA也能得到很好的結(jié)果,如Qiagen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶Omniscript和Sensiscript,以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme。

去除gDNA

RNA中存在的基因組DNA(gDNA)污染可能是終PCR反應(yīng)中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的原因,目前已存在很多方法去除gDNA,比如通過DNAase對提取的RNA進(jìn)行預(yù)處理。

以上方法無可避免會造成RNA的蛋白污染,因而這里介紹一種可繞開酶處理的方法,即針對RNA設(shè)計一種包含內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物,如此DNA就不會產(chǎn)生擴(kuò)增抑或即便擴(kuò)增了其條帶大小也與cDNA不同。

但值得注意的是,使用該方法時基因中要沒有假基因存在,假基因(pseudogene)是插入到基因組中剪切mRNA的DNA拷貝,否則也會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

而對于沒有內(nèi)含子的原核RNA,gDNA的去除則更是基因表達(dá)準(zhǔn)確測量的一個至關(guān)重要的因素。使用DNAase處理RNA是*的方法,Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA。此外,具有g(shù)DNA Eraser(Takara Bio)的PrimeScript RT試劑盒也可去除gDNA,且能在不到20分鐘之內(nèi)快速完成RNA的cDNA合成。

檢測RNA分子的完整性

毫無疑問,RNA質(zhì)量對cDNA合成結(jié)果會產(chǎn)生重要的影響,而不同批次間RNA質(zhì)量差異也導(dǎo)致RT-PCR產(chǎn)生不同的結(jié)果。所以在進(jìn)行RT-PCR前,應(yīng)該檢查RNA條帶的質(zhì)量,可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。通常完整的真核RNA應(yīng)包括28S和18S RNA條帶,且較大的條帶的強(qiáng)度應(yīng)是較小條帶的兩倍左右,另外兩個條帶強(qiáng)度大致相同也是可以的。

而另一種準(zhǔn)確測量RNA質(zhì)量的方法是使用Agilent BioAnalzyer儀器,它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數(shù)值(RNA Integrity Number,RIN)后給出一個質(zhì)量的量化標(biāo)準(zhǔn)。RIN為8-10,則表示RNA質(zhì)量非常好;當(dāng)RIN值低于7,則說明RNA可能有降解,可能會導(dǎo)致一些罕見信息的丟失等問題。RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外,準(zhǔn)確評估產(chǎn)量也很重要。產(chǎn)量的準(zhǔn)確性會受到以下因素的影響:測量儀器的準(zhǔn)確性、DNA的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準(zhǔn)確測量產(chǎn)量,小編我更喜歡使用Nanodrop進(jìn)行UV定量。

該儀器不需要稀釋樣品,并且具有非常寬的測量RNA的范圍。以小編的經(jīng)驗,它可以準(zhǔn)確讀取到10ng / ul。而傳統(tǒng)的紫外分光光度法應(yīng)避免使用大容量的比色皿,因為這需要耗費大量的樣品。此法的缺點是也可在樣品中測量基因組DNA,如果從RNA提取過程殘留鹽或酚,則會增加吸光度,使得RNA的OD值變得更高。

而解決此問題一個方法是使用熒光染料,Ribogreen是一種RNA特異性染料,可通過熒光來測量RNA產(chǎn)量。現(xiàn)在,Nanodrop已經(jīng)具備檢測Ribogreen所發(fā)出熒光的功能。

兩步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分兩種類型:一步法(One-step PCR)和兩步法(Two-steps PCR),具體操作見下圖。前者,RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一個反應(yīng)管中進(jìn)行的;而后者,RT 反應(yīng)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)單獨進(jìn)行。

盡管這兩種方法都能得到終的結(jié)果,但是每種方法都有優(yōu)缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點。

一步RT-PCR消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟,不僅消除了控制物污染的潛在來源,而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時間。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特異性的,靈敏度高,常用于分析低表達(dá)水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的基因被擴(kuò)增,且需要在轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增間尋找一個平衡。

所以當(dāng)時間對實驗很重要時,一般采用一步法,如檢測RNA病毒,也適用于高通量分析。由于該法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高,因而在需要測量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時,也可采用此方法。

而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA,然后儲存cDNA用于后續(xù)實驗,可檢測大量基因;在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后,可更好地控制實驗過程;又因只有少量的轉(zhuǎn)錄本被用于PCR,則可能從RNA 分離到RT反應(yīng)的抑制劑(如乙醇、酚及胍鹽等)都被稀釋了。

但是兩步RT-PCR更耗費時間,且?guī)砦廴镜目赡苄愿撸籖T過程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄RNA,否則會影響qPCR的啟動效率,進(jìn)而帶來不同的實驗結(jié)果,因此對于每個RT反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件。

如果你需要對同一樣本的多個目標(biāo)進(jìn)行分析時,可選擇兩步RT-PCR。另外,當(dāng)RNA的存儲是個問題時,好是進(jìn)行兩步RT-PCR,因為cDNA在-20℃是穩(wěn)定的。

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