活性氧（ROS）檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)是通過(guò)多種方法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)ROS水平的關(guān)鍵手段，其核心原理基于ROS與特定探針的氧化反應(yīng)生成可檢測(cè)信號(hào)。以下是詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)：

一、常用檢測(cè)方法

1. 熒光探針?lè)ǎ―CFH-DA法）

• 原理：DCFH-DA穿透細(xì)胞膜后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為無(wú)熒光的DCFH，后者被ROS氧化生成綠色熒光的DCF。熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。

• 儀器：流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀。

• 激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：不同試劑盒參數(shù)略有差異，常見(jiàn)激發(fā)波長(zhǎng)488-502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525-530 nm。

2. 組織及液體樣本檢測(cè)

• 組織樣本：使用008 ROS探針（紅色熒光，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)510/610 nm），需優(yōu)先使用新鮮組織，凍存樣本可能導(dǎo)致ROS損失。

• 液體樣本：采用BBoxiProbe® O11探針（綠色熒光，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)488/516 nm），適用于細(xì)胞培養(yǎng)基等液體環(huán)境。

3. 線粒體特異性檢測(cè)

• 使用高內(nèi)涵儀器結(jié)合化合物（如魚(yú)藤酮）干預(yù)線粒體功能，或采用MitoSOX Red探針（紅色熒光）靶向線粒體超氧化物。

4. 其他方法

• 電子順磁共振（EPR） ：檢測(cè)O??、·OH等自由基，需結(jié)合自旋捕獲技術(shù)。

• 化學(xué)發(fā)光法：利用Lucigenin等探針檢測(cè)超氧化物，無(wú)需激發(fā)光源。

二、實(shí)驗(yàn)步驟（以DCFH-DA法為例）

1. 樣本準(zhǔn)備

• 細(xì)胞類(lèi)型：貼壁或懸浮細(xì)胞需調(diào)整探針裝載方式。貼壁細(xì)胞建議檢測(cè)時(shí)匯合度達(dá)50-70%。

• 組織樣本：優(yōu)先使用新鮮組織，凍存樣本需驗(yàn)證ROS殘留量。

2. 探針裝載

• 濃度：DCFH-DA工作液通常為5-20 μM（按1:250至1:1000稀釋母液）。

• 孵育條件：37℃避光孵育20-40分鐘，懸浮細(xì)胞需后續(xù)洗滌去除未進(jìn)入探針。

• 順序調(diào)整：

• 短刺激（<4小時(shí)）：先裝載探針，后處理細(xì)胞。

• 長(zhǎng)刺激（>4小時(shí)）：先處理細(xì)胞，后裝載探針。

3. 檢測(cè)與參數(shù)設(shè)置

• 儀器選擇：根據(jù)樣本量選擇熒光酶標(biāo)儀（高通量）或共聚焦顯微鏡（亞細(xì)胞定位）。

• 陽(yáng)性對(duì)照：使用Rosup（50-100 mM）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有效性。

4. 數(shù)據(jù)分析

• 熒光強(qiáng)度通過(guò)軟件（如ImageJ）量化，對(duì)比處理組與對(duì)照組的差異。

三、注意事項(xiàng)

1. 樣本處理

• 避免反復(fù)凍融，尤其是組織樣本，否則ROS易降解。

• 檢測(cè)前用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞，減少背景干擾。

2. 實(shí)驗(yàn)條件控制

• 溫度：光照實(shí)驗(yàn)需控制溫度在20-29℃，避免溫度波動(dòng)影響ROS生成。

• 避光操作：探針及樣本需全程避光，防止熒光淬滅。

3. 探針優(yōu)化

• 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型調(diào)整探針濃度，避免濃度過(guò)高導(dǎo)致毒性或背景信號(hào)。

• 縮短探針裝載后至檢測(cè)的時(shí)間（建議<1小時(shí)），減少假陽(yáng)性。

4. 質(zhì)量控制

• 設(shè)置無(wú)探針對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（Rosup）及空白組，排除自發(fā)熒光影響。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

• 疾病機(jī)制研究：如氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病、癌癥的關(guān)系。

• 藥物評(píng)價(jià)：通過(guò)ROS水平變化評(píng)估藥物抗氧化效果。

• 環(huán)境毒理學(xué)：檢測(cè)污染物（如紫外線、化學(xué)物質(zhì)）誘導(dǎo)的ROS累積。